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ABI_7500熒光定量PCR儀如何使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制?
更新時(shí)間:2023-07-10   點(diǎn)擊次數(shù):2200次
   在ABI_7500熒光定量PCR儀實(shí)驗(yàn)中,使用內(nèi)標(biāo)可以有效地進(jìn)行質(zhì)量控制,以下是使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制的步驟:
 
  1.內(nèi)標(biāo)的設(shè)計(jì)和選擇:設(shè)計(jì)一個(gè)特異性的內(nèi)標(biāo)是第一步,這個(gè)內(nèi)標(biāo)可以是基因組上的一個(gè)特定序列或者是一個(gè)已知的基因。這個(gè)內(nèi)標(biāo)的長(zhǎng)度應(yīng)該與待檢測(cè)的基因組序列相當(dāng),以便于在同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí),可以擴(kuò)增出與待檢測(cè)基因組大小相同的產(chǎn)物。
 
  2.內(nèi)標(biāo)加入的比例:標(biāo)的比例應(yīng)該與待檢測(cè)的基因組序列相同。這可以通過在反應(yīng)體系中同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)和待檢測(cè)的基因組序列的引物和探針來實(shí)現(xiàn)。
 
  3.內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增:內(nèi)標(biāo)應(yīng)該與待檢測(cè)的基因組序列同時(shí)擴(kuò)增。這可以通過在反應(yīng)體系中同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)和待檢測(cè)的基因組序列的引物和探針來實(shí)現(xiàn)。
 
  4.內(nèi)標(biāo)的檢測(cè):在結(jié)束后,通過熔解曲線分析產(chǎn)物,可以檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正確地?cái)U(kuò)增。如果內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增出了正確的產(chǎn)物,那么說明實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制是有效的。
 
  5.內(nèi)標(biāo)的驗(yàn)證:在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí),需要驗(yàn)證內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增效果。這可以通過對(duì)一系列已知濃度的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行PCR反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。如果內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期的熔解曲線,那么就可以確認(rèn)內(nèi)標(biāo)是有效的。
 
  6.內(nèi)標(biāo)的應(yīng)用:通過使用內(nèi)標(biāo),可以評(píng)估熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的精密度和靈敏度。內(nèi)標(biāo)可以用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)中的變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,從而確定實(shí)驗(yàn)的精密度。同時(shí),通過使用內(nèi)標(biāo)還可以評(píng)估實(shí)驗(yàn)的靈敏度,因?yàn)閮?nèi)標(biāo)的濃度可以影響實(shí)驗(yàn)的線性范圍和檢測(cè)下限。
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