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ABI_Stepone 熒光定量PCR儀的兩個(gè)誤區(qū)可別陷進(jìn)去了!
更新時(shí)間:2021-05-19   點(diǎn)擊次數(shù):1473次
   ABI_Stepone 熒光定量PCR儀因操作方便、運(yùn)行速度快、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,受到越來越多的分子生物學(xué)研究者青睞。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟的今天,也許對你來說,最難得不是實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的問題——而是選擇哪一種熒光定量PCR儀——你要征詢實(shí)驗(yàn)室成員的意見、分析實(shí)驗(yàn)室目前乃至將來的需求、平衡實(shí)驗(yàn)室的預(yù)算,更要詳細(xì)研究各種極富吸引力的宣傳資料。面對各種不同性能的產(chǎn)品,您又該如何選擇呢?
  建議大家走出認(rèn)識熒光定量PCR的兩個(gè)誤區(qū):
  誤區(qū)一:儀器通道越多越好
  隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用,多重?cái)U(kuò)增越來越熱鬧,熒光定量PCR儀也不能幸免。從最初推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,眼花繚亂的選擇讓人無所適從,就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區(qū)。
  在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時(shí),為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種熒光染料)或?qū)S玫腞eference dye ,這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測通道。這樣以來,真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個(gè),而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的,有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認(rèn)ABI_Stepone 熒光定量PCR儀的有效檢測通道尤為重要,不能單單只聽宣傳。
  考慮多重?zé)晒舛縋CR的通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況出發(fā),多重PCR并非人人適用、人人可用,因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了。
  誤區(qū)二:real-time PCR儀無需梯度功能
  對于使用染料法的定量PCR反應(yīng),雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度(Tm值),但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,對于特殊片斷,經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,退火溫度細(xì)微的差異對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在特定范圍內(nèi)按照梯度變化,根據(jù)結(jié)果,一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。
  不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個(gè)非常重要,因?yàn)門aq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
  使用有梯度功能的ABI_Stepone 熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過程,簡化了摸索 PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn),既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率,又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。
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